一种用于纠正使细胞对DNA损伤敏感的突变的CRISPR替代方案

Fanconi贫血是一种罕见的遗传病，其中必需的DNA修复途径基因发生突变，破坏了DNA损伤反应。范可尼贫血患者会出现血液学并发症，包括骨髓衰竭，并且易患癌症。范可尼贫血血液学症状的唯一治疗方法是同种异体造血干细胞移植，患者从捐赠者那里接受健康的干细胞。虽然这可能会治愈或预防某些疾病的并发症，但干细胞移植可能会带来额外的困难，包括移植物抗宿主病(GvHD)和加剧的癌症风险。1个

人们越来越关注应用CRISPR-Cas9等基因组编辑技术来纠正患者来源细胞中的范可尼贫血突变以进行自体移植，在这种情况下，将纠正后的干细胞返还给患者。然而，这种疾病提出了一个独特的挑战：如何在对DNA损伤特别敏感的细胞中应用基因组编辑技术?范可尼贫血细胞无法解决传统CRISPR-Cas9基因编辑在目标DNA中产生的双链断裂，这阻碍了研究人员使用这种方法有效纠正致病突变。

在国际分子科学杂志上发表的一项研究中，由BrandenMoriarity和BeauWebber领导的明尼苏达大学的一个研究小组使用基于Cas9的工具，称为碱基编辑器(BEs)来编辑范可尼贫血患者衍生细胞中的基因，而不会诱导双-DNA链损伤。2BE是由切割靶DNA的Cas9酶(nCas9)和将胞苷转化为尿苷(胞嘧啶碱基编辑器，CBE)或将腺苷转化为肌苷(腺苷碱基编辑器，ABE)的脱氨酶制成的融合蛋白。在DNA复制或修复期间，BE靶向的位点在CBE的情况下被重写为胸腺嘧啶，在ABE的情况下被重写为鸟嘌呤。

尽管碱基编辑器不会诱导双链断裂，但它们仍然会在DNA上形成切口并触发DNA修复反应。因此，研究人员首先检查了CBE和ABE是否适用于患者来源细胞中的非范可尼贫血基因。“你知道，这是一个谜，因为[范可尼贫血患者的细胞]DNA修复缺陷。所以我们不确定……我们认为它可能会起作用，但不如正常细胞。但实际上，它基本上在同一水平上工作。所以这非常令人兴奋，”Moriarity解释道。

研究小组随后证明，CBE和ABE可以纠正原代患者成纤维细胞和类淋巴母细胞系中FANCA基因中引起范可尼贫血的突变。碱基编辑恢复了FANCA蛋白的表达，并提高了患者来源的细胞在DNA破坏性化学物质存在的情况下的生长能力。此外，在培养中，具有修正的FANCA突变的成纤维细胞长得比碱基编辑失败的细胞长。最后，研究人员评估了BE是否可以纠正不同范可尼贫血基因的突变。他们使用一种算法预测，大多数范可尼贫血突变都可以通过BE或另一种称为素数编辑(PE)的nCas9融合技术进行纠正，这种技术能够进行大量的基因插入和删除。

这项工作紧随能源、环境和技术研究中心和苏黎世联邦理工学院的另一个研究小组的预印本之后，他们研究了患者血细胞系中的ABE。该小组还利用BE技术有效地针对范可尼贫血基因，他们的研究更进了一步：他们纠正了患者来源的造血干细胞中的突变。3个这是莫里亚蒂和韦伯无法做到的——因为这种疾病是一种骨髓衰竭综合症，这些细胞很稀缺。“基本上，这些患者没有干细胞，”巴黎西泰大学想象研究所的高级研究员兼实验室主任AnnaritaMiccio解释说，她没有参与这两项研究。“这些都是非常具有挑战性的实验，而且比实验更重要的是，[治疗]范可尼贫血的挑战恰恰是细胞数量。”

尽管存在这一挑战，研究人员已经为基因组编辑作为范可尼贫血的一种治疗方法奠定了基础，而无需双链DNA断裂。“我认为我们所做的研究是一个很好的、可靠的概念证明，并为下一步奠定了基础，但当然，这不是故事的结局，”韦伯说。