使用彩色TSFG显微镜对红细胞和氧合作用进行无标记成像

细胞和组织依靠红细胞(RBC)的循环来供氧。双光子(2P)显微镜是使用外源性磷光探针测量红细胞微循环和血氧的参考技术。它越来越多地用于研究脑氧合和生理学。

然而，基于2P的方法面临一些限制。基于磷光的氧合测量通常涉及几十毫秒范围内的像素时间。他们探测血浆而不是直接探测红细胞。基于荧光的微循环测量依赖于血液标记或受到相对较弱的自发荧光的影响。此外，深度2P显微镜受离焦背景的限制。

EmmanuelBeaurepaire博士领导的一组科学家展示了一种使用活体斑马鱼作为模型的独特光谱三次谐波(THG)成像方法。

最近出现的高功率光学参量放大器(OPA)和1.3和1.7μm范围内MHz重复率的光源为使用三光子(3P)激发的深层组织显微镜开辟了新的视角。这些新型激光技术的一个附带好处是它们还可以实现基于THG的高效无标记成像。

THG是一种三阶多光子成像模式，突出显示细胞和组织中的界面和光学异质性，其应用范围从细胞和发育生物学到神经科学。THG显微镜很容易与3P荧光显微镜结合使用，以结合两种对比方式进行深层组织成像。在小鼠和鱼脑的活体成像中，THG主要显示血管、富含髓磷脂的区域和颅骨界面。

尽管THG对比度到目前为止主要用于结构成像和作为空间地标，但预计可以获得某种程度的吸收物体的化学特异性。THG显微镜的光谱版本可能与探测非荧光物体的吸收特性特别相关。它可以提供与红细胞的特定对比，并可能以无标记的方式报告它们在体内的氧合状态。

这种功能成像方法的开发需要两件事。首先，它需要建立和表征来自红细胞的THG信号的波长依赖性。它还需要实施与移动物体(如流动的红细胞)的显微镜兼容的高效光谱成像方案。

研究团队开发了一种基于同时测量THG和三阶和频生成(TSFG)信号的光谱成像新实验方案。该团队研究了几种发射波长，包括血红蛋白的Soret吸收带。他们证明他们的方法提供了化学特异性对比。

这些结果基于分离的红细胞、斑马鱼胚胎和活的成年斑马鱼大脑成像实验中的电子共振。该团队证明，他们的方法可用于测量体内氧合动力学。在医疗技术和支持未来生物学研究方面有广泛的应用。